Arbejdsprincippet for en Pasteur-pipette er primært baseret på tyngdekraft-drevet strømning og kapillærvirkning kombineret med manuel kontrol af lufttryksforskelle for at lette aspiration og overførsel af væsker.
Manuel sugekontrol: Operatøren suger den brede ende af pipetten -enten oralt eller ved hjælp af en hjælpegummikolbe-for at skabe undertryk i røret og derved trække væske ind i den fine spids.
Tyngdekraft-drevet dispensering: Når suget er frigivet, flyder væsken naturligt ud under påvirkning af tyngdekraften; dispensering kan også assisteres ved forsigtigt at klemme pipettekroppen eller vippe modtagebeholderen.
Dråbereproducerbarhed: Ved at kalibrere forholdet mellem "dråber pr. milliliter" muliggør pipetten omtrentlig kvantitativ overførsel, hvilket gør den velegnet til procedurer, der kræver repeterbarhed frem for absolut præcision.
Sterilitetssikring: Før brug kan en bomuldsprop indsættes i den brede ende og steriliseres for at forhindre mikrobiel kontaminering under håndtering-en praksis, der er særlig almindelig i mikrobiologiske eksperimenter.